protocole

« BIO-N01-24 – Biologie cellulaire Protocole de laboratoire INITIATION AUX TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE ET ÉTUDE DE L’EFFET D’UN TRAITEMENT PHYSIQUE DE L’EAU CONTAMINÉE COMPARÉ AU TRAITEMENT CHIMIQUE OBJECTIFS : 1.

Initiation à la technique d’ensemencement par épuisement à l'aide du manche de Koch. 2.

Initiation à la technique d’ensemencement complet avec un écouvillon. 3.

Initiation à la technique de la dilution en série suivie de l’étalement sur gélose avec la tige de verre. 4.

Compréhension de la méthode du dénombrement des colonies bactériennes pour évaluer le nombre de bactéries contenues dans un échantillon. 5.

Compréhension de l'importance des pratiques aseptiques.  Éviter que des microorganismes non souhaités contaminent les cultures et les expériences.  S'assurer que seuls les microorganismes d'intérêt sont présents. 6.

Application de la démarche scientifique :  Formuler une hypothèse  Identifier les différents facteurs  Vérifier l’hypothèse par l’expérimentation  Collecter et analyser les résultats 7.

Rédaction d’un rapport de laboratoire 8.

Développement des aptitudes de travail en équipe.  Créer un environnement de travail collaboratif et positif  Améliorer les compétences de communication entre les membres de l’équipe  Combiner les compétences et les connaissances de chacun Département de Biologie-A24 Collège Jean-de-Brébeuf - Page 1 BIO-N01-24 – Biologie cellulaire Protocole de laboratoire TRAVAIL PRÉPARATOIRE  Lisez le protocole de laboratoire au complet et visualisez mentalement chaque étape de manipulation.  Visionnez les vidéos en cliquant sur les liens suivants : - https://moodle.brebeuf.qc.ca/mod/book/view.php?id=44798&chapterid=1816 - https://gestesdelascience.ccdmd.qc.ca/video/technique-densemencement-complet/  Avant votre arrivée en laboratoire, formulez une hypothèse et faites des prédictions sur l’effet d’un traitement physique par filtration de l’eau contaminée comparée au traitement chimique par chloration.  Lisez le Guide de manipulation des micropipettes disponible sur Léa.  Avant de commencer un travail pratique en microbiologie, il est crucial d’être responsable et préventif et surtout de prendre le temps de lire les consignes de sécurité suivantes : 1.

Il est strictement défendu de manger, de boire ou de mâcher de la gomme. 2.

Déposez votre sac dans votre casier ou à l'entrée du laboratoire. 3.

Portez des vêtements de protection : sarrau attaché, chaussures fermées et lunettes de laboratoire. 4.

Attachez les cheveux longs et le foulard, le cas échéant. 5.

Repérez la couverture anti-feu, la douche et le lave-yeux. 6.

Les bijoux portés aux mains sont prohibés. 7.

Lavez vos mains au savon avant et après les manipulations. 8.

Évitez de toucher votre peau et vos yeux et de porter vos doigts à la bouche. 9.

Ne jetez rien dans les lavabos.

Utilisez les conteneurs appropriés pour les matériaux contaminés. 10.

Avisez-nous de tout accident. 11.

Ne laissez jamais sans surveillance le brûleur de Bunsen allumé. 12.

Assurez-vous que le robinet de gaz est fermé avant de quitter le laboratoire. 13.

N’ouvrez jamais le couvercle de la boite de Pétri durant les prises des résultats. 14.

Suivez les procédures de nettoyage établies. Département de Biologie-A24 Collège Jean-de-Brébeuf - Page 2 BIO-N01-24 – Biologie cellulaire Protocole de laboratoire INTRODUCTION La microbiologie est la branche des sciences biologiques qui étudie les microorganismes invisibles à l'œil nu tels que les bactéries, les champignons unicellulaires et les protozoaires.

Ces organismes sont omniprésents dans notre environnement et jouent un rôle crucial, tant positif que négatif, dans divers domaines tels que la santé, l'agriculture, et l'industrie.

En microbiologie, les techniques d'ensemencement sont essentielles pour isoler, identifier et quantifier les microorganismes présents dans des échantillons.

Elles permettent aux scientifiques d'obtenir des informations précises sur la présence et la concentration des microorganismes dans divers échantillons, facilitant ainsi la recherche, le diagnostic et le contrôle de la qualité. En laboratoire, les bactéries sont cultivées sur des milieux fournissant les nutriments essentiels dont elles ont besoin pour se multiplier et former ainsi des colonies bactériennes.

Après ensemencement, les boîtes de Pétri contenant les bactéries sont placées dans des incubateurs.

Ils permettent de maintenir des conditions de température et d'humidité optimales pour la croissance des bactéries et favoriser la formation de colonies.

Une colonie bactérienne est un groupe visible de bactéries qui s’est développé à partir d'une seule bactérie. Il est important lorsque l’on fait de la microbiologie de maintenir un environnement exempt de tout germe, on parle d’environnement aseptique.

L’utilisation d’un bec Bunsen permet de créer un environnement stérile, où les chances de contamination sont réduites, et approprié pour les techniques de microbiologie.

La flamme générée provoque un mouvement ascendant de l'air chaud qui pousse les microorganismes en suspension dans l'air vers le bas.

Afin de maximiser l'efficacité de cette zone stérile, le brûleur de Bunsen doit être placé de telle sorte que l'air chaud se déplace au-dessus des surfaces de travail et du matériel utilisé (géloses, éprouvettes, etc.). Il faut se limiter aux manipulations requises pour ne pas perturber l'air et ainsi introduire des contaminants. Département de Biologie-A24 Collège Jean-de-Brébeuf - Page 3 BIO-N01-24 – Biologie cellulaire Protocole de laboratoire MATÉRIEL Avant de commencer les manipulations, vérifier la liste de matériel et cocher la case associée à chaque item. Par équipe  5 boîtes de Pétri contenant la gélose TSA stérile Par paillasse  1 éprouvette :  1 éprouvette d’eau contaminée marquée en bleu • contenant 2 mL d’hypochlorite (EC)  2 éprouvettes de 9,9 mL de saline stérile (SS)  1 manche de Koch  2 écouvillons stériles  1 tige de verre recourbée  1 bécher contenant de l’alcool 70 %  Micropipette P1000  Boite à embouts stériles  1 brûleur Bunsen  1 support à éprouvettes  1 marqueur sharpie (eau de javel) marquée J OU • stérile vide et un entonnoir avec son papier filtre  Bac de décontamination des écouvillons  1 bécher de décontamination (pour entonnoir et papier filtre souillés)  Bac de décontamination des embouts  Ruban adhésif  Désinfectant pour la surface de travail  Désinfectant Proviodine pour le lavage des mains  1 étuve à 37oC (pour incuber les géloses de toutes les équipes) PROTOCOLE I.

Initiation à la technique d’ensemencement par épuisement à l'aide du manche de Koch Cette technique permet d’isoler des colonies bactériennes individuelles à partir d'un mélange de microorganismes en réduisant progressivement la densité des bactéries sur la gélose.

En général, elle est utilisée couramment dans les laboratoires de diagnostic médical.

À l’aide du manche de Koch stérilisé à la flamme, une petite quantité de l'échantillon est prélevée, puis étalée en zigzag sur une partie de la gélose. Avant de procéder à l’ensemencement de la saline stérile (1.SS) et de l’eau contaminée (1.EC) sur la gélose TSA à l’aide du manche de Koch, il faut faire les étapes suivantes : Département de Biologie-A24 Collège Jean-de-Brébeuf - Page 4 BIO-N01-24 – Biologie cellulaire Protocole de laboratoire 1.

Désinfectez la surface de travail en vaporisant l’eau de Javel.  2.

Désinfectez vos mains à l’aide de la solution de Proviodine.

 3.

Allumez le brûleur et le régler de façon à obtenir une flamme vive.  4.

À l’aide d’un marqueur et sans enlever le couvercle, tracez une ligne sur le fond externe d’une boite de pétri (pas sur le couvercle) pour créer 2 sections égales: 1.SS et 1.EC.

 Manipulations : Les manipulations se font par équipe de 3.

Une démonstration est donnée avant les manipulations. A.

Ensemencement de la saline stérile (1.SS) 1.

Chauffez au rouge le fil de platine du manche de Koch (Fig.

1a). 2.

Laissez refroidir le manche de Koch quelques secondes.   3.

À l’aide de l’auriculaire et de la paume de la main qui tient le manche de Koch, enlevez le bouchon de l’éprouvette contenant la saline stérile (Fig.

1b).

 4.

À deux reprises, passez à la flamme l’embouchure de l’éprouvette de la saline stérile (Fig.

1c).

 5.

Près de la flamme, trempez l’anse du manche de Koch dans la saline stérile (Fig.

1d).

 6.

Prélevez une petite quantité de la saline stérile avec l’anse du manche.  7.

À deux reprises, passez de nouveau à la flamme l’embouchure de l’éprouvette de la saline stérile (Fig.

1e).

 8.

Remettez le bouchon et déposez l’éprouvette de la saline stérile (Fig.

1f).  9.

Placez la boite de Pétri près du brûleur et le retournez à l’endroit et soulevez le couvercle.

 10.

Délicatement et à l’aide du manche de Koch, faites des stries du plus étroit vers le plus large sur la surface de la moitié de la gélose (section 1.SS).

 11.

Refermez le couvercle du vase de Pétri.  12.

Chauffez immédiatement au rouge le fil de platine du manche de Koch et puis laissez refroidir quelques secondes avant de le déposer sur votre surface de travail.

 Département de Biologie-A24 Collège Jean-de-Brébeuf - Page 5 BIO-N01-24 – Biologie cellulaire Protocole de laboratoire Figure1 : Illustration des étapes de la saisie d’une éprouvette contenant une solution bactérienne et du prélèvement d’échantillon à l’aide du manche de Koch (Source : Pearson Education France). B.

Ensemencement de l’eau contaminée (1.EC) Répétez les manipulations 1 à 12, mais en effectuant les striations sur l’autre moitié de la surface de la gélose 1.EC avec l’échantillon.... »